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齊考諾肽(Ziconotide)可用于醫(yī)治神經(jīng)性和非神經(jīng)性疼痛 。 Ziconotide通過與位于傷害體會方式初級傳入神經(jīng)元末端的N型鈣通道 (N-typecalciumchannels)結(jié)合而起功效 ,從而減少突觸傳遞并具備有效的抗傷害功效 。
齊考諾肽作為 一種環(huán)型 肽,且含有三對二硫鍵 ,其氨基酸序列為:H-Cys(1)-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys(2)-Ser-Arg-Leu-Met -Tyr-Asp -Cys(3)-Cys(1)-Thr-Gly-Ser-Cys(2)-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys(3)-NH2,其三對二硫鍵的配對已在序列中表示出。
齊考諾肽(Ziconotide)3D化學(xué)式,作為 一種含多對二硫鍵的環(huán)肽 ,人工合成 時使分子式中的二硫鍵準(zhǔn)確產(chǎn)生是人造的一個難題 。
通過巰基氧化 產(chǎn)生多肽分子式中的二硫鍵時,只含一對二硫鍵時很容易挑選反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn) ,如通過氣體 ,I2 ,H2O2 ,汞鹽等氧化 ,可是 ,像齊考諾肽那樣必須氧化產(chǎn)生三對二硫鍵的情況較為復(fù)雜,反應(yīng) 會產(chǎn)生多種多樣同分異構(gòu)體 ,因而需選用適宜的氧化方式 ,即可選擇性氧化 。
要實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn),一般是選用不一樣的硫基維護(hù)基的氧化差異來做到規(guī)定 ,齊考諾肽的三對二硫鍵各自以氣體 ,碘作為氧化物 ;通過差異氧化先產(chǎn)生由Trt維護(hù)的1-8,16 -20兩對二流鍵,再通過經(jīng)典氧化產(chǎn)生由Acm維護(hù)的15 -25 二硫鍵;氧化全過程由MS ,HPLC 檢測 ,以后 由HPLC 純化得到成品 。
齊考諾肽線性肽的固相生成
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環(huán)氧樹脂媒介的制取
反應(yīng)罐中加入 Fmoc-Linker-MB -HA -Resin環(huán)氧樹脂 ,用DCM溶脹,排干,加入20 %(摩爾分?jǐn)?shù) ,相同 )吡啶 /DMF 溶液 ,震蕩反應(yīng)20 min ,去除Fmoc官能團(tuán) ,用DMF清洗 3遍,排干。
加入 Fmoc-Cys(trt)-OH ,TBTU,HOBT和DIEA,N2震蕩反應(yīng)1h,用DMF清洗環(huán)氧樹脂去除不必要的FmocCys(trt)0H制得聯(lián)接環(huán)氧樹脂 。
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線性肽鏈的生成 (經(jīng)營規(guī)模 :AA :HB :DIEA=1:3:3:6),去除 Fmoc維護(hù)基:向配有聯(lián)接環(huán)氧樹脂的反應(yīng) 柱中加入 20 %吡啶 /DMF 溶液 ,震蕩反應(yīng)20min 。
用DMF清洗環(huán)氧樹脂3遍,產(chǎn)生肽鍵:向反應(yīng)柱中加入定量分析的維護(hù)碳水化合物 (用DMF10mL融解,加入定量分析的HBIU和DIEA),N2 震蕩反應(yīng)1h。排干 ,用DMF清洗3遍。
肽鏈增加:將前一步生成的環(huán)氧樹脂肽作為下一步生成的羥基成分,反復(fù)以上接肽全過程 ,開展 25次接肽反應(yīng)制得環(huán)氧樹脂線性肽鏈 。
檢驗(yàn)反應(yīng)過程 :用茚三酮顯色劑法律性檢驗(yàn)反應(yīng)過程 ,分辨各步接肽的終點(diǎn)站 ,第-步去除Fmoc維護(hù)基中若環(huán)氧樹脂肽呈深藍(lán)色 ,表明Fmoc維護(hù)基已去除 。
若在產(chǎn)生肽鍵流程中若環(huán)氧樹脂肽呈深藍(lán)色 ,表明反應(yīng)不徹底 ,需再度縮合反應(yīng) ,當(dāng)環(huán)氧樹脂肽呈無色全透明狀,表示羥醛縮合順利完成 。
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環(huán)氧樹脂線性肽鏈的激光切割,在燒瓶中加入干躁的環(huán)氧樹脂線性肽鏈 ;TFA ,EDT ,對甲苯酚,苯甲乙酰氯和水(87.5:5:2.5 :2.5 :2.5 ),攪拌下于室溫反應(yīng)2h。
旋蒸 ,洗劑與滲瀝液合拼,用沒有水醫(yī)用乙醚 (5倍~10倍量 )析晶,離心分離機(jī) ,沉積用小量沒有水醫(yī)用乙醚清洗 ,真空干燥機(jī)得粗肽。
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粗品的分離純化
HPLC 純化標(biāo)準(zhǔn) :C18柱,粒度 5μm,檢驗(yàn)波220 mm ,沖洗掉液A:0.1 %TFA 溶液 ;沖洗掉液B:0.1 %TFA 乙腈溶液 ;挑選沖洗掉梯度方向10 %~100 %,沖洗掉時間15 min,流動速度1mL /min ,粗肽經(jīng)HPLC純化制得純的線性肽。
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二硫鍵的產(chǎn)生
(1)第一步氧化產(chǎn)生兩對二硫鍵
在燒杯中加入純品線性肽,純凈水,用氨水調(diào)至pH8上下 ,攪拌下于室溫反應(yīng) 24 h。 濃縮制得粗肽,經(jīng)HPLC純化制得含2個二硫鍵的肽段,齊考諾肽(Ziconotide)只有兩對二硫鍵時的3D化學(xué)式
(2)第二步氧化產(chǎn)生第三對二硫鍵
在燒瓶中加入以上得到的肽段,25 %甲醇溶液 和碘8eq ,攪拌下于室溫反應(yīng) 2h,滴入硫代硫酸鈉至溶液無色 ,濃縮制得粗肽,經(jīng)HPLC純化制得成品 。
寫到最后:
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