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無論是商品化蛋白或是公司內(nèi)部自身開發(fā)設(shè)計(jì)的蛋白 ,在提純得到蛋白到應(yīng)用以前通常必須保存第幾周至好多個(gè)月不一 。
在此期間維持蛋白理化性質(zhì)的穩(wěn)定性尤為重要 ,文中簡略介紹了造成蛋白質(zhì)集聚,沉積 ,轉(zhuǎn)性等情況的要素 ,并詳細(xì)介紹了一些 保存對(duì)策來提高蛋白質(zhì)的可靠性 。
如今就帶大伙兒打開濃濃的干貨知識(shí)之行 。
蛋白質(zhì) 理化性質(zhì)改變的要素
蛋白質(zhì)可靠性發(fā)生問題的第一個(gè)特點(diǎn)通常是發(fā)生沉積 ,沉淀中通常帶有非純天然的蛋白質(zhì)集聚物,且這類集聚一般是不可逆的,通常不能夠修復(fù)自然的蛋白質(zhì)的功能 ,除非是將集聚物融解于轉(zhuǎn)性液,如尿素溶液或鹽酸胍中,再根據(jù)復(fù)性除去轉(zhuǎn)性液使蛋白質(zhì)分子再次折疊 ,修復(fù)純天然構(gòu)像 。
(1)強(qiáng)烈 刺激性 下的蛋白質(zhì) 沉積 及應(yīng)對(duì)措施
多種多樣強(qiáng)烈的傷害可以造成蛋白沉淀 ,包含pH 值轉(zhuǎn)變 ,環(huán)境溫度轉(zhuǎn)變,融凍 ,在拌和(蛋白質(zhì)暴露于氣體 -水頁面 ),過慮 (蛋白質(zhì)暴露于液體 -固態(tài)頁面 )等,以上要素均可以造成蛋白空間布局的轉(zhuǎn)變,進(jìn)而產(chǎn)生沉積 。
當(dāng)溶液中非純天然蛋白質(zhì)集聚物充足小時(shí) ,如二聚體,四聚體等,蛋白質(zhì)可以維持可溶解情況 。
掌握這種集聚物的成分水準(zhǔn)十分關(guān)鍵 ,由于 與純天然 蛋白 對(duì)比 ,其構(gòu)造和活力很有可能早已 發(fā)生了轉(zhuǎn)變 ,即使這種集聚物保持 在2%-3%那樣很低的水準(zhǔn) ,也可以拼裝形核 ,進(jìn)而推動(dòng)蛋白質(zhì)迅速的集聚和沉積。
這就可以表述為何某類 蛋白在比較穩(wěn)定的保存 一段時(shí)間后,忽然 產(chǎn)生很多沉積,可溶集聚 物在做到開啟能量源轉(zhuǎn)化成的閥值水準(zhǔn)以前沉積不容易 產(chǎn)生 ,將帶有可溶集聚物的蛋白質(zhì)暴露于強(qiáng)烈的條件中,如拌和或過慮 ,可以更快的推動(dòng)能量源的生成和沉積 。
(2)氨基酸主鏈發(fā)生變化造成蛋白質(zhì)沉積及應(yīng)對(duì)措施
除開 強(qiáng)烈刺激性 ,氨基酸主鏈發(fā)生變化也是蛋白沉淀的主要要素 ,如有氧化和水解反應(yīng)到時(shí)候導(dǎo)致蛋白作用 改變 。
酶促反應(yīng)結(jié)構(gòu)域 處的甲硫氨酸殘基的氧化會(huì)造成蛋白質(zhì)失活,在甲硫氨酸和胱胺酸 殘基及其帶有芳香族主鏈的氨基酸 (谷氨酸 ,組氨酸和酪氨酸 )最易于產(chǎn)生化學(xué)作用 ,分子結(jié)構(gòu)氧的存有 ,賦形劑及其 器皿中還原性污染物質(zhì)都能夠引物設(shè)計(jì)化學(xué)作用 ,比如帶有氧化還原反應(yīng)活力的金屬離子,瓶蓋中帶有殘余的原子團(tuán)殘?jiān)?/span>等均可造成化學(xué)作用 ,一般添加一些增稠劑 ,如綿白糖 ,對(duì)純天然情況夯實(shí) ,可以減緩暴露殘廢的氧化率。
水解作用既可以出現(xiàn)在氨基酸的主鏈 (像天冬酰胺和谷氨酰胺殘基 產(chǎn)生的脫氟苯 功效)還可以產(chǎn)生在肽碳鏈 上,造成肽官能團(tuán)的激光切割 ,天冬酰胺殘基的脫氟苯功效高寬比在于相鄰的殘基 ,若下一個(gè)氨基酸是甘氨酸 ,其溶解的速率更快 。
多肽鏈部分的軟性可以危害脫氟苯 功效 ,大部分主要的外界因素 如pH 值,緩沖溶液類型可以加快這些反映 ,在堿性 pH 和濃度較高的的緩沖溶液中,反應(yīng)速率尤其快。
蛋白質(zhì)普遍的多種保存方法
(1)在液體狀態(tài)下不凍結(jié)保存
蛋白質(zhì)一般在2-8℃開展 短期內(nèi)保存 ,這對(duì)保持蛋白的可靠性尤其合理 ,殊不知蛋白質(zhì)即使不產(chǎn)生集聚沉積 ,也會(huì)產(chǎn)生遲緩的化學(xué)降解過程 ,蛋白質(zhì)在溶液情況下的集聚水平最少 ,大部分蛋白質(zhì)平穩(wěn)的pH范疇較小,在這里范疇以外,蛋白質(zhì)去折疊的工作能力加強(qiáng)。
非特異性增稠劑 ,如綿白糖 ,在其濃度做到 0.5 M時(shí),對(duì)保持 蛋白質(zhì)的可靠性具備不錯(cuò)的實(shí)際效果 。 很多添加物,如硫酸銨,甘氨酸 ,聚乙二醇 ,綿白糖 等,可以根據(jù)優(yōu)先選擇 排阻 (PreferentialExclusion)的方式保持 蛋白質(zhì) 的熱學(xué) 可靠性 ,在其中檸檬酸鈉鹽緩沖溶液實(shí)際效果最好 。
此外 一種保持蛋白質(zhì)可靠性不錯(cuò)的辦法 是減少蛋白質(zhì)的濃度 ,較低濃度的可以減少蛋白質(zhì)的集聚率,這類速率對(duì)蛋白質(zhì)的濃度十分比較敏感 , 殊不知 ,蛋白質(zhì)的濃度也不能過低,如小于0.1 mg /ml ,過較低濃度的的蛋白會(huì)導(dǎo)致非特異性的吸咐到器皿的內(nèi)壁 ,進(jìn)而導(dǎo)致損害 。
除此之外 ,蛋白質(zhì)緩沖溶液的含鹽量針對(duì)保持蛋白質(zhì) 溶液的可靠性十分關(guān)鍵 ,如PBS緩沖溶液中,NaCl的濃度通常保持在150 mM ,這是由于溶液中正離子的電荷屏蔽掉減少了蛋白質(zhì)分子間的電荷 -電荷 排斥功效 ,這種離子濃度的選擇必須實(shí)際的實(shí)驗(yàn)提升
(2)在凍結(jié)環(huán)境溫度下保存
冷藏保存是蛋白質(zhì)存儲(chǔ)的基本方式 。
在低溫情況下,蛋白質(zhì)溶解的速度減少 ,在超低溫不造成蛋白質(zhì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)性時(shí),試品可以平穩(wěn)保存好多個(gè) 月,在-80 ℃甚至于 更低的環(huán)境溫度 下,蛋白 的保存時(shí)間更久。
殊不知,冷藏也會(huì)造成很多蛋白的轉(zhuǎn)性,這種要素包含超低溫 ,物質(zhì)的量濃度的濃度 ,冰-液體頁面的產(chǎn)生 ,pH 值的強(qiáng)烈 波動(dòng) 等。
凍存蛋白最易犯的不正確是應(yīng)用磷酸鹽緩沖液 ,超低溫下的堿性鹽結(jié)晶體 ,而酸堿性鹽依然可溶解 ,那樣倍他米松 的pH值降低許多 ,如pH4,這會(huì)導(dǎo)致 很多蛋白產(chǎn)生轉(zhuǎn)性 ,在冷藏期內(nèi) pH 不太發(fā)生變化的緩沖溶液有檸檬酸鈉鹽,Tris,組氨酸等。
在蛋白質(zhì)溶液中添加保護(hù)劑可以合理減少蛋白轉(zhuǎn)性 和沉積 ,這種方式 包含 :添加凡士林 ,鹽析鹽和二糖,通常濃度高過 0.3 M,可具有不錯(cuò)的功效,添加表活劑 ,其能與蛋白質(zhì)分子競(jìng)爭冰-液體頁面 來抑止 蛋白質(zhì)變性,通常濃度 低至0.1 %,就能 得到有效的實(shí)際效果 ,添加 BSA 或高聚物 也可以抑止冷藏造成的蛋白質(zhì)去折疊 ,一般添加占比為百分之幾十 。
根據(jù) 提升蛋白質(zhì)的起止濃度 ,可以提高在融凍過程中蛋白質(zhì)制取物對(duì)損害的耐受力 , 當(dāng)蛋白質(zhì)的起止濃度提高時(shí),轉(zhuǎn)性蛋白質(zhì)分子的百分?jǐn)?shù)也會(huì)降低 。針對(duì) -80 ℃和-20 ℃保存 ,優(yōu)選 -80 ℃。
一方面超低溫可以比較大水平減少蛋白溶解速度 ;另一方面因?yàn)?/span> -20 ℃電冰箱常常電源開關(guān)的特性 ,環(huán)境溫度一般 達(dá)不上 -20℃,尤其是靠門的地區(qū) ,特別是無霜冰箱中還會(huì)繼續(xù)發(fā)生不斷融凍的狀況 。
并且,-20 ℃貼近 一些 鹽的共融點(diǎn),在這個(gè)環(huán)境溫度左右易導(dǎo)致結(jié)晶的不斷融凍 ,造成蛋白質(zhì)變性。
最終必須指出的是,蛋白要避免重復(fù)融凍 ,散裝凍存 ,每回融化 一支 ,隨后應(yīng)用 。
(3)凍干 保存
凍干是將溶劑或懸浮物質(zhì)在較低溫度下冷藏 ,隨后將其由固態(tài)立即提升為氣體的一種干燥方式 ,
該方式可以非常好地維持成分骨架的可靠性 ,而且在復(fù)融后都不 改變 。
凍干 一般 包含三個(gè)過程 :預(yù)凍結(jié),提升干燥 (或稱第一階段干燥 ),分析干燥 (或稱第二階段干燥 ),雖然凍干可以比較好 的保持蛋白的可靠性 ,可是 在凍干過程中加上必需的增稠劑以防止蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)性至關(guān)重要 ,這在其中并以還原型的海藻糖和綿白糖對(duì)蛋白質(zhì)的維護(hù)最有效。
凍干過程要避免應(yīng)用還原型糖,如葡萄糖水,麥牙糖,乳清蛋白等,其會(huì)造成美拉德(Maillard)反映溶解蛋白質(zhì) ,在冷藏期內(nèi) ,維護(hù)水平在于起止的總糖 濃度 ;在干燥期內(nèi) ,維護(hù)功效在于糖與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比。
冷藏維護(hù)是因?yàn)?/span>從蛋白質(zhì)表面的優(yōu)先選擇排阻 ,那樣便提升了去折疊的活化能 ,在干燥期內(nèi) ,伴隨著與蛋白質(zhì)分子表面 產(chǎn)生水合作用的水被除去 ,蛋白質(zhì)分子去折疊 ,糖可以 利用在凍干蛋白質(zhì)的缺水部位融合氫氧根離子來防止這類毀壞 。
因?yàn)?/span>凍干加工工藝繁雜 ,設(shè)備價(jià)格昂貴,耗能比較大 ,這也是一般實(shí)驗(yàn)室承受不住的,通常做為蛋白保存的最終選擇 。
針對(duì)凍干初學(xué)者而言 ,設(shè)定下列狀態(tài)變量會(huì)降低探索時(shí)間 :制取蛋白的原始濃度相對(duì)性高些,可以提升對(duì)冷藏的耐受力 ,并降低要干燥的容積 ;應(yīng)用充足的海藻糖或綿白糖來抑止在冷藏和干燥中的蛋白去折疊。
假如蛋白質(zhì)制劑可以承受冷藏 ,糖與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比例在1-2中間 ,通常可以合理的防止在干燥過程中蛋白質(zhì)的去折疊 。 在冷藏 期內(nèi) ,假如必須 維護(hù) ,糖的起止濃度通常必須做到200 -300mM才可以達(dá)到最好維護(hù) ,最終,必須明確的是蛋白質(zhì)保存樣本中,盡量不能帶有蛋白酶,蛋白酶的催化具備精確性 ,催化高效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)地高過有機(jī)物催化劑 。
寫到最后:
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