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核酸的提純
在分子克隆的全部操作中,最主要的操作是核酸的提純 。 其重要環(huán)節(jié)是去蛋白質(zhì) ,通常只需用酚/氯仿 , 氯仿抽提核酸的溶液就可以 。每每必須把復(fù)制有某一些常用的酶消滅或除去以便開展下一步時(shí),可開展這類抽提 。
然而 ,若想從細(xì)胞裂解液等繁雜的分子結(jié)構(gòu)混合物中提純核酸 ,則要首先用 一些蛋白水解酶消化吸收絕大多數(shù)蛋白質(zhì)后,再用有機(jī)溶劑抽提 。
這種廣泛的蛋白酶包含鏈霉蛋白酶及蛋白酶K等,他們對(duì)多種多樣純天然蛋白均有活力 ,用酚氯仿抽提 :這二種有機(jī)溶劑共用 ,比獨(dú)立用酚抽提的除蛋白實(shí)際效果更好。
進(jìn)而用氯仿抽提則可去除核酸產(chǎn)品中的痕量酚。
①核酸樣品置有蓋小離心管中,添加等容積的酚/氯仿 。
②旋渦混勻管內(nèi)容物,使呈乳狀 。
③12000 ×g室內(nèi)溫度離心15 秒。
④水相移進(jìn)另一 離心管 ,棄去兩相頁(yè)面和有機(jī)相。
⑤反復(fù)流程 ①-④步操作 ,直到兩相頁(yè)面上見不上蛋白質(zhì)才行
⑦按以下核酸濃縮法沉淀回收核酸 。
核酸 的濃縮
運(yùn)用較廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法 。在適中濃度價(jià)格陽(yáng)離子存有下,添加一定量的乙醇 后,所產(chǎn)生有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收 ,乃至對(duì)低至pg量的DNA或RNA ,也可定量回收 。 回收的核酸可按所需濃度 ,再溶解適度的緩沖液中。具體步驟時(shí),可以向含樣品的小離心管中添加 V/10 價(jià)格 陽(yáng)離子鹽存儲(chǔ)液2V無(wú)水乙醇 ,混勻 ,放冰水浴中15 -30 min ,取下目測(cè)平衡,0-4度,12000g,離心10min 。吸棄上清,再另70%乙醇0.5 -1ml ,12000 g,0-4度清洗 離心 2min 。吸棄上清,沉淀 用汽油泵排干或開啟外蓋晾曬后,溶解適度容積的緩沖液中。
價(jià)格陽(yáng)離鹽的挑選 ,關(guān)鍵根據(jù)以下考慮 :用醋酸銨可降低dNTP的共沉淀 ,但在之后要作核酸的磷酸化時(shí)要防止用醋酸銨,因銨離子是T,多核苷酸激酶的明顯抑制劑。 若用較高濃度的乙醇沉淀RNA 時(shí),常見LiCl,因LiCl在乙醇中溶解性很高,不隨核酸共沉淀 。 帶有 SDS的核酸樣品 ,應(yīng)應(yīng)用 NaCl ,這時(shí)該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶解 。DNA 和RNA沉淀 ,大多數(shù)應(yīng)用醋酸鈉(pH5.2)。
DNA ,RNA 的定量
精確的方式是紫外分光光度法 。 但此方法規(guī)定核酸樣品是純凈的(即無(wú)明顯的蛋白質(zhì),酚,瓊脂糖或其他核酸 ,多肽鏈等污染物的產(chǎn)品 )。
用紫外光度計(jì)測(cè)量260 nm 和280nm 2個(gè)光波長(zhǎng)處的吸光 ,隨后 ,按IA260等同于50 μg/ml 雙鏈DNA。 40 μg/ml單鏈DNA或RNA及20 μg/ml 多肽鏈寡核苷酸 。
測(cè)算 樣品 成分 。
260nm 和280 nm兩個(gè)讀數(shù)的參考值 (A260 /A280),可體現(xiàn)核酸的純凈度 。
DNA和RNA 純品 的A260 /A280的值各自為1.8 和2.0 假如樣品中有蛋白質(zhì)或酚的環(huán)境污染 ,則A260 /A280將明顯小于此值,這時(shí)就沒法對(duì)樣品中的核酸開展精準(zhǔn)定量。
可將樣品裂解后再作定量測(cè)量 。有充足實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)的人,光憑樣品電泳后溴化乙錠上色螢光帶的強(qiáng)度 ,就可以大概判斷出樣品中的核酸成分 ,故她們常未作核酸的紫外分光光度法定量 。
寫到最后:
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