核酸的提純

在分子克隆的全部操作中，最主要的操作是核酸的提純 。 其重要環(huán)節(jié)是去蛋白質(zhì) ，通常只需用酚/氯仿 , 氯仿抽提核酸的溶液就可以 。每每必須把復(fù)制有某一些常用的酶消滅或除去以便開展下一步時(shí)，可開展這類抽提 。

然而 ，若想從細(xì)胞裂解液等繁雜的分子結(jié)構(gòu)混合物中提純核酸 ，則要首先用 一些蛋白水解酶消化吸收絕大多數(shù)蛋白質(zhì)后，再用有機(jī)溶劑抽提 。

這種廣泛的蛋白酶包含鏈霉蛋白酶及蛋白酶K等，他們對(duì)多種多樣純天然蛋白均有活力 ，用酚氯仿抽提 ：這二種有機(jī)溶劑共用 ，比獨(dú)立用酚抽提的除蛋白實(shí)際效果更好。 

進(jìn)而用氯仿抽提則可去除核酸產(chǎn)品中的痕量酚。

①核酸樣品置有蓋小離心管中，添加等容積的酚/氯仿 。

②旋渦混勻管內(nèi)容物，使呈乳狀 。

③12000 ×g室內(nèi)溫度離心15 秒。

④水相移進(jìn)另一 離心管 ，棄去兩相頁(yè)面和有機(jī)相。

⑤反復(fù)流程 ①－④步操作 ，直到兩相頁(yè)面上見不上蛋白質(zhì)才行

⑦按以下核酸濃縮法沉淀回收核酸 。

核酸 的濃縮

運(yùn)用較廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法 。在適中濃度價(jià)格陽(yáng)離子存有下，添加一定量的乙醇 后，所產(chǎn)生有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收 ，乃至對(duì)低至pg量的DNA或RNA ，也可定量回收 。  回收的核酸可按所需濃度 ，再溶解適度的緩沖液中。具體步驟時(shí)，可以向含樣品的小離心管中添加 V/10 價(jià)格 陽(yáng)離子鹽存儲(chǔ)液2V無(wú)水乙醇 ，混勻 ，放冰水浴中15 －30 min ，取下目測(cè)平衡，0－4度，12000g，離心10min 。吸棄上清，再另70%乙醇0.5 －1ml ，12000 g，0－4度清洗 離心 2min 。吸棄上清，沉淀 用汽油泵排干或開啟外蓋晾曬后，溶解適度容積的緩沖液中。

價(jià)格陽(yáng)離鹽的挑選 ，關(guān)鍵根據(jù)以下考慮 ：用醋酸銨可降低dNTP的共沉淀 ，但在之后要作核酸的磷酸化時(shí)要防止用醋酸銨，因銨離子是T，多核苷酸激酶的明顯抑制劑。 若用較高濃度的乙醇沉淀RNA 時(shí)，常見LiCl，因LiCl在乙醇中溶解性很高，不隨核酸共沉淀 。 帶有 SDS的核酸樣品 ，應(yīng)應(yīng)用 NaCl ，這時(shí)該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶解 。DNA 和RNA沉淀 ，大多數(shù)應(yīng)用醋酸鈉（pH5.2）。

DNA ，RNA 的定量

精確的方式是紫外分光光度法 。 但此方法規(guī)定核酸樣品是純凈的（即無(wú)明顯的蛋白質(zhì)，酚，瓊脂糖或其他核酸 ，多肽鏈等污染物的產(chǎn)品 ）。 

用紫外光度計(jì)測(cè)量260 nm 和280nm 2個(gè)光波長(zhǎng)處的吸光 ，隨后 ，按IA260等同于50 μg/ml 雙鏈DNA。 40 μg/ml單鏈DNA或RNA及20 μg/ml 多肽鏈寡核苷酸 。

測(cè)算 樣品 成分 。 

260nm 和280 nm兩個(gè)讀數(shù)的參考值 （A260 /A280），可體現(xiàn)核酸的純凈度 。 

DNA和RNA 純品 的A260 /A280的值各自為1.8 和2.0 假如樣品中有蛋白質(zhì)或酚的環(huán)境污染 ，則A260 /A280將明顯小于此值，這時(shí)就沒法對(duì)樣品中的核酸開展精準(zhǔn)定量。 

可將樣品裂解后再作定量測(cè)量 。有充足實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)的人，光憑樣品電泳后溴化乙錠上色螢光帶的強(qiáng)度 ，就可以大概判斷出樣品中的核酸成分 ，故她們常未作核酸的紫外分光光度法定量 。

寫到最后：

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