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非天然氨基酸的應(yīng)用現(xiàn)狀和前景
作者:固拓多肽合成公司    發(fā)布于:2021年11月08日
摘要:背景及概述 蛋白質(zhì)僅僅用20種天然氨基酸執(zhí)行了一系列顯著功能,僅有的20種天然氨基酸攜有的功能基團(tuán)數(shù)量有限,無(wú)法滿足化學(xué)、生物科學(xué)研究和應(yīng)用中對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的需求。目前,通過(guò)化學(xué)修飾、基因定點(diǎn)突變和計(jì)算機(jī)輔助蛋白質(zhì)設(shè)計(jì),雖然對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改造賦予了天然蛋白質(zhì)新的功能,但這些方法都依賴于20種天然氨基酸本身;其用于修飾改造的功能基團(tuán)僅有巰基、羥基、羧基、氨基等幾種有限基團(tuán),功能化方式十分有限。與此相反,可人為賦予多樣性功能基團(tuán)的非天然氨基酸(UnnaturalAminoAcids)在蛋白質(zhì)修飾中表現(xiàn)突出,這些非天然氨基酸含有酮基、醛基、疊氮、炔基、烯基、酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸根等多樣性功能基團(tuán),可進(jìn)行多種修飾反應(yīng),如:點(diǎn)擊化學(xué)、光化學(xué)、糖基化、熒光顯色等反應(yīng)。通過(guò)非天然氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾給其結(jié)構(gòu)和功能的理論研究與應(yīng)用帶來(lái)了新的契機(jī)。

背景及概述

蛋白質(zhì)僅僅用20種天然氨基酸執(zhí)行了一系列顯著功能,僅有的20種天然氨基酸攜有的功能基團(tuán)數(shù)量有限,無(wú)法滿足化學(xué)、生物科學(xué)研究和應(yīng)用中對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的需求。目前,通過(guò)化學(xué)修飾、基因定點(diǎn)突變和計(jì)算機(jī)輔助蛋白質(zhì)設(shè)計(jì),雖然對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改造賦予了天然蛋白質(zhì)新的功能,但這些方法都依賴于20種天然氨基酸本身;其用于修飾改造的功能基團(tuán)僅有巰基、羥基、羧基、氨基等幾種有限基團(tuán),功能化方式十分有限。與此相反,可人為賦予多樣性功能基團(tuán)的非天然氨基酸(UnnaturalAminoAcids)在蛋白質(zhì)修飾中表現(xiàn)突出,這些非天然氨基酸含有酮基、醛基、疊氮、炔基、烯基、酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸根等多樣性功能基團(tuán),可進(jìn)行多種修飾反應(yīng),如:點(diǎn)擊化學(xué)、光化學(xué)、糖基化、熒光顯色等反應(yīng)。通過(guò)非天然氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾給其結(jié)構(gòu)和功能的理論研究與應(yīng)用帶來(lái)了新的契機(jī)。

非天然氨基酸的應(yīng)用現(xiàn)狀和前景

 

種類

 

一系列非天然氨基酸已經(jīng)被用在細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾,其精確性和效率非常高;它們大多都是20種天然氨基酸的衍生物,現(xiàn)今報(bào)道的UAA衍生物有苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、丙氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、絲氨酸衍生物、賴氨酸衍生物等。

 

修飾方法與過(guò)程

 

1. 化學(xué)合成法

固相肽合成方法和半合成方法相結(jié)合能合成出含非天然氨基酸的大片段蛋白質(zhì)。例如,在化學(xué)連接中,一個(gè)C端含一硫脂的多肽將和一個(gè)N端含半胱氨酸的多肽反應(yīng),在經(jīng)歷一個(gè)?;嘏藕?,硫脂鍵形成一個(gè)肽鍵將這兩個(gè)片段連接在一起。固相肽合成和連接技術(shù)已經(jīng)用于修飾蛋白質(zhì)骨架、紅細(xì)胞生成素同系物、熒光探針、信號(hào)蛋白、離子通道、組蛋白等。然而這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用受所需要保護(hù)基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)、連接位點(diǎn)、蛋白質(zhì)折疊等限制。

2. 體外生物合成法

體外生物合成方法已經(jīng)合成了含UAA的蛋白質(zhì)。在這個(gè)技術(shù)中,縮短了的tRNAs被酶法連接到化學(xué)氨酰化的核苷酸上,這些目的tRNA從連接的天然氨基酸上去耦掉,同時(shí)與非天然氨基酸結(jié)合;隨后細(xì)胞翻譯系統(tǒng)在相應(yīng)的空白密碼子或者編碼密碼子下,使用這些帶有非天然氨基酸的氨酰化的tRNAs合成蛋白質(zhì),但含有非天然氨基酸的氨酰化tRNA加合物穩(wěn)定性很差。

3. 顯微注射法

在體內(nèi),通過(guò)顯微注射技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾來(lái)自于體外生物合成方法的拓展。如非洲爪蟾蜍卵母細(xì)胞被顯微注射進(jìn)2種RNA:一種是編碼蛋白質(zhì)的mRNA,其目標(biāo)位點(diǎn)含有UAG終止密碼子;一種是合成的氨?;^tRNA(suppressortRNA),它能裝載相應(yīng)的UAA。在體內(nèi),通過(guò)UAG終止密碼子對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾,其中非天然氨基酸有酪氨酸同系物、a一基氨基酸等。但它繼承了體外生物合成方法的缺點(diǎn),即校正tRNA必須在體外化學(xué)氨?;瘞蟄AA,氨?;膖RNA不能被重復(fù)利用,只能應(yīng)用于能進(jìn)行顯微注射的細(xì)胞口。

4. 營(yíng)養(yǎng)缺陷型法

50年以前,研究者發(fā)現(xiàn)許多天然氨基酸的同系物能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),分析發(fā)現(xiàn)在這些氨基酸同系物存在下合成的蛋白質(zhì),其天然氨基酸已被同系物替換,這是因?yàn)榘滨?tRNA合成酶(aminoaeyl-tRNAsynthetase,aaRS)不能明顯地把天然氨基酸和其同系物嚴(yán)格區(qū)分開(kāi)來(lái),例如,正亮氨酸(norleucine)能被甲硫氨酰-tRNA合成酶識(shí)別,氟苯丙氨酸(p—fluorophenylalanine)能被苯丙氨酰一tRNA合成酶識(shí)別。同時(shí)用4(s)一氟脯氨酸,4-氟苯丙氨酸和6~氟色氨酸(3種非天然氨基酸對(duì)脂肪酶進(jìn)行修飾,其脂肪酶的結(jié)構(gòu)和活性均未被破壞。DNA聚合酶是一種高的動(dòng)力學(xué)酶,用大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株對(duì)DNA聚合酶中32個(gè)脯氨酸替換成4(R)一氟脯氨酸(4(R)一fluoroproline,(4(R)一F)Pro),完成了(4(R)一F)Pro對(duì)DNA聚合酶的修飾,而DNA聚合酶在其保真度、活性和敏感方面均未發(fā)生變化。但運(yùn)用營(yíng)養(yǎng)缺陷性菌株來(lái)進(jìn)行非天然氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)的修飾,沒(méi)有位點(diǎn)特異性、細(xì)胞不能持續(xù)生長(zhǎng),且非天然氨基酸僅是天然氨基酸的同系物。

5. 翻譯后修飾法

蛋白質(zhì)翻譯后修飾在生命體中具有十分重要的作用,它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,功能更為完善,調(diào)節(jié)更為精細(xì),作用更為專一。常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙?;取Mㄟ^(guò)在麥芽糖結(jié)合蛋白、人類生長(zhǎng)激素和分枝桿菌磺基轉(zhuǎn)移酶蛋白中,引入一個(gè)含6個(gè)氨基酸的共有序列(LCTPSR),它能被甲酰甘氨酸生成酶識(shí)別并修飾,從而生成醛基基團(tuán),新生成的醛基基團(tuán)能進(jìn)一步引人生物物理探針和抗原表位標(biāo)簽到蛋白質(zhì)中。用疊氮基酪氨酸(3-azidoty—rosine)對(duì)鈣調(diào)蛋白進(jìn)行修飾,再用三芳膦同系物對(duì)其進(jìn)行選擇性的生物酰化修飾,從而開(kāi)創(chuàng)了一種新的蛋白質(zhì)位點(diǎn)選擇性翻譯后修飾方法。

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應(yīng)用現(xiàn)狀和前景

1. 生物催化

1)提高酶催化活性

在生物技術(shù)領(lǐng)域,酶經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后能夠在有機(jī)溶劑中高效地發(fā)揮催化作用,并表現(xiàn)出新穎的催化性能?,F(xiàn)在研究者也引入許多催化基團(tuán)到蛋白質(zhì)中,細(xì)菌磷酸三酯酶PTE)以非??斓霓D(zhuǎn)化效率催化農(nóng)藥對(duì)氧磷水解,其活性已接近進(jìn)化限制。利用tRNA'cu/TyrRS對(duì),用L一(7-羥基香豆素一4一基)乙基甘氨酸或L一(7一甲基香豆素一4一基)乙基甘氨酸(對(duì)PTE進(jìn)行修飾,其PTE的催化效率提高了8~11倍,這為酶的分子改造提高其活性提供了一條新的思路。

2)增強(qiáng)酶熱穩(wěn)定性

特氟龍能使阻燃和防火氟化高分子材料表面固化,受此啟發(fā),紐約大學(xué)金·蒙克萊爾研究小組開(kāi)創(chuàng)了一種能增強(qiáng)蛋白質(zhì)界面的工藝過(guò)程。借助營(yíng)養(yǎng)缺陷性菌株和在培養(yǎng)基中加入對(duì)氟苯丙氨酸,制備了對(duì)氟苯丙氨酸磷酸酯酶,性能測(cè)試顯示,這種酶蛋白具有類似于特氟龍的耐熱性能,在60℃的高溫下仍可保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,同時(shí)活性和功能沒(méi)有絲毫減弱。在同樣溫度下,天然蛋白質(zhì)分子中的氫鍵會(huì)斷裂,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變并發(fā)生蛋白質(zhì)變性。通過(guò)此氟化氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)的修飾,給蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定研究開(kāi)辟了新的視野。

2. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能探針

光誘導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)存在自然界中,它能調(diào)節(jié)許多細(xì)胞和生物功能,Wang等。用光反應(yīng)非天然氨基酸對(duì)一(2一四唑)苯丙氨酸(p-(2一tetrazole)phenylalanine,(p-Tpa))對(duì)肌紅蛋白進(jìn)行修飾,這給用光來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能提供了可能。對(duì)甲氧基苯丙氨酸([C]p—methoxypheny1alanine)對(duì)P450進(jìn)行修飾,修飾后P450和其它原子結(jié)合,可以用來(lái)闡明P450在配體位點(diǎn)的構(gòu)象改變,同時(shí)也可以解釋哺乳動(dòng)物P450的復(fù)雜動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象。

3. 藥物蛋白

在醫(yī)療蛋白開(kāi)發(fā)上,大量同源修飾蛋白的產(chǎn)生是理想的_5。如對(duì)許多抗原和抗原決定簇來(lái)說(shuō),一個(gè)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)是需要的,利用校正tRNAcLyur/TyrRS對(duì),用對(duì)乙酰苯丙氨酸(p-acety|一phenylalanine)對(duì)抗體抗原結(jié)合片段進(jìn)行修飾,這給多聚物醫(yī)療蛋白的產(chǎn)生提供了可能。

4. 蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)

蛋白質(zhì)交聯(lián)在疫苗開(kāi)發(fā)、藥物傳遞、功能型水合膠方面發(fā)揮著重要作用。這些交聯(lián)雖然發(fā)生在自然中,但實(shí)驗(yàn)室很難應(yīng)用這個(gè)方法。通過(guò)3,4一二羥一L一苯丙氨酸(3,4-dihydroxy—L-phenylala—nine)對(duì)GFP蛋白進(jìn)行修飾,從而實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)與多聚糖的生物交聯(lián),這給蛋白質(zhì)交聯(lián)和合成生物學(xué)的發(fā)展帶來(lái)了新的希望。用對(duì)炔丙基氧苯丙氨酸(p-propargyloxyphenyla1anine,(pPa))完成了二氫葉酸還原酶和超折疊綠色熒光蛋白的修飾,由于pPa含有酮基,它能在一價(jià)銅離子介導(dǎo)下使炔基與疊氮基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),同時(shí)pPa對(duì)UV不敏感,這使異源蛋白質(zhì)間的交聯(lián)也成為了可能。


制備


一種制備非天然氨基酸及其手性拆分的方法,本法以金剛烷甲酸為原料,制備3-羥基金剛烷甲酸,再經(jīng)過(guò)氯化、氧化等得到2-(3-羥基-1-金剛烷基)乙醛酸,與鹽酸羥胺反應(yīng)得到3-羥基金剛烷乙醛酸肟,用還原劑還原并用Boc酸酐保護(hù)得到N-叔丁氧羰基-3-羥基金剛烷基甘氨酸。再用有機(jī)堿拆分得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羥基金剛烷基甘氨酸和(R)-N-叔丁氧羰基-3-羥基金剛烷基甘氨酸兩種非天然氨基酸。本發(fā)明與已有技術(shù)相比,改進(jìn)了合成工藝,反應(yīng)條件溫和,環(huán)境污染小,適合工業(yè)化生產(chǎn)。

 

寫(xiě)到最后

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